RNAscope在皮膚成纖維細胞單細胞測序后驗證中的應用
單細胞測序技術是近年來迅速發展的生命科學前沿技術，它在單細胞水平揭示細胞的基因表達狀態，反映細胞間的異質性，為生命科學的研究提供了獨特的視角。近年來，單細胞測序技術在神經科學、腫瘤、發育生物學、微生物學等眾多領域發揮著重要的作用，成為了生命科學極具潛力的熱點研究工具。單細胞測序結果的真實性，不同檢測信息在組織中的特異分布，與檢測結果的生物學意義密切相關。故在單細胞測序后重要靶點的原位回溯具有重要的生物學分析意義。RNAscope原位雜交技術能直觀可視化基因表達的空間位置，無懼新發現靶點無免疫組化抗體，分泌因子或者靶點為非編碼RNA等情況，因此RNAscope對于單細胞測序的結果回溯到組織原位上進行驗證提供了重要的技術手段。本文為大家解讀2020年發表的使用RNAscope技術在單細胞測序后驗證中的應用系列文章。
2020年在communication biology上發表的一篇題為Single-cell Transcriptomes of The Human Hkin Reveal Age-related Loss of Fibroblast Priming的研究中，利用單細胞測序系統分析了人皮膚成纖維細胞的轉錄組，鑒定了四個主要的成纖維細胞亞群，這些亞群可以在空間上定位并顯示不同的分泌、間充質和促炎功能，為人類真皮成纖維細胞的功能特化提供了證據，并且發現細胞特性的部分喪失是人類真皮中與年齡相關的重要變化。
在這項研究中，研究人員從兩名年輕（25歲和27歲）和三名年長（53歲、69歲和70歲）的捐贈者身上獲取了全皮膚樣本，而且為了盡量減少皮膚的光老化效應，這些樣本是從男性捐贈者的防曬區域的腹股溝髂區獲得的。然后對獲得的皮膚樣本進行單細胞測序，單細胞測序結果以及數據分析鑒定了4個成纖維細胞亞群，第一個亞群是位于網狀真皮中的分泌性網狀成纖維細胞，第二個亞群是位于乳頭狀真皮中的分泌性乳頭狀成纖維細胞，第三個亞群被預測具有廣泛的定位，顯示出更大的間充質潛能的間充質成纖維細胞，第四個亞群是促炎癥細胞群（見下圖）。
為了進一步表征和驗證單細胞測序鑒定的四個成纖維細胞亞群，研究人員使用Bio-Techne旗下ACD公司的RNAscope技術，在福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）皮膚切片中原位檢測了每個亞群最具代表性的標志基因的表達。研究人員使用的是RNAscope多通道熒光檢測的方法，分別檢測了分泌性網狀成纖維細胞的標志基因CTHRC1（下圖a中綠色信號點）和分泌性乳頭狀成纖維細胞的標志基因APCDD1的表達（下圖a中紅色信號點），并檢測了泛成纖維細胞標志基因PDGFRA的表達作為對照（下圖a中白色信號點），RNAscope的檢測結果證實了每個分泌亞群在乳頭狀真皮層和網狀真皮層中的位置，并且通過RNAscope結果的定量分析可以統計分別表達CTHRC1與APCDD1的陽性細胞比例，從而得到在乳頭狀真皮層和網狀真皮層中兩個分泌亞群細胞的相對數量。
對于另外兩個成纖維細胞亞群，研究人員同樣使用RNAscope多通道熒光檢測的方法，分別檢測了促炎成纖維細胞的標志基因CCL19與APOE的表達（下圖b中綠色信號點為RNAscope檢測到的CCL19的RNA信號，紅色信號點為APOE的RNA信號），與間充質亞群的標志基因ASPN的表達（下圖c中綠色信號點）。RNAscope的檢測結果證實促炎成纖維細胞顯示出更廣泛的分布，在脈管中的分布證實其與血管系統的優先關聯。間充質亞群主要定位于網狀真皮，尤其是毛囊附近。因此，RNAscope原位檢測結果為研究人員通過單細胞轉錄組學獲得的發現提供了重要的證據，并為檢測特定成纖維細胞亞群建立了標記。
RNAscope技術是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司研發的RNA原位雜交產品，在近年來的生物檢測領域發展迅速。與傳統的RNA原位雜交相比，RNAscope技術屬于新一代RNA原位雜交技術，其特異性的雙Z探針設計避免了傳統長鏈RNA探針的弊端，配以自身級聯放大檢測原理，可以高效敏感地檢測到目標RNA。該方法的具體優勢如下：
應用廣泛
使用RNAscope技術，靶點RNA為大于等于300個堿基的特異序列，即可進行探針設計。因而RNAscope技術可以應用于幾乎所有物種，所有組織以及所有基因的檢測。
特異性強
RNAscope獨特的雙Z（ZZ） 探針設計有效的防止了探針的非特異性結合，同時降低了背景干擾。由于結合在非特異性位點的單個的Z 探針不會產生完整的信號放大分子結合位點，并會在雜交過程中被洗脫掉，從而防止非特異性信號的放大，使得探針的信號具有高度特異性。探針設計合成需要2~4周時間即可完成。
靈敏度高
RNAscope方法檢測每個RNA 分子時，只需三對雙Z（ZZ）探針即可完成雜交和信號的可視化。
單分子可視化和單細胞定量
使用RNAscope技術雜交上三對及以上雙Z 探針即可在標準的顯微鏡下呈現可觀察到的點狀信號。ACD公司提供的分析軟件更可以定量每一個單細胞內RNA 的表達水平。
兼容降解的RNA
由于RNAscope三對雙Z探針即可檢測到目標RNA，而通常針對靶點RNA設計的探針為20對雙Z 探針，因而即使目標RNA發生部分降解，仍可以穩定有效地檢測到靶點RNA。
檢測結果穩定一致性
RNAscope技術用到的探針以及所有檢測試劑全部由工業化合成，且該技術針對不同樣本類型（冰凍切片， 石蠟切片，懸浮細胞，貼壁細胞等）已經有成熟的實驗操作流程，故使得RNAscope技術檢測結果具有穩定性和一致性。除了可以在實驗室進行手工操作外，該產品也可以在Leica以及羅氏Ventana自動平臺上運行，為結果的一致性和穩定性提供了可靠的依據。
多通道多靶點同時檢測
由于RNAscope技術可以同時進行多通道探針雜交以及信號放大，故在可見光檢測中可以在同一張切片上同時檢測兩個靶點；而在熒光檢測過程中，可以在同一張切片上檢測三個或三個以上靶點RNA。
References
1. Lloren? Solé-Boldo, Günter Raddatz, Sabrina Schütz, et al. Single-cell transcriptomes of the human skin reveal age-related loss of fibroblast priming. Commun Biol. 2020; 23;3(1):188.
- 上一篇：百靈克獨家出品-實驗室移動熱轉印標簽打印機 2022/6/10
- 下一篇：黑色素瘤：異常的信號轉導通路和治療方法丨探秘癌癥（二） 2022/6/10
